制备多肽色谱柱有哪些注意事项

分析色谱比较常见的吸附剂颗粒直径为5μm，制备色谱经常使用的吸附剂颗粒直径更加大。特别是加样量超出样品存储量时（柱过载），柱效与分析色谱相比影响比较小。当柱过载时，大颗粒直径填充柱同小颗粒直径填充柱分离蛋白和多肽的效果差不多。所以，制备色谱较常用10μm及以上颗粒直径的吸附剂。粒径分布通常都比较宽。与0.5μm或更窄的粒径分布范围不一样的是，制备色谱的粒径范畴更广，比如10~15μm。制备色谱柱成本较低，所以一般会选择选用大粒子。

1、柱内径

因为样品存储量比较低，纯化流程不怎么使用内径低于2mm的小孔柱。大批量多肽时，使用10mm和22mm内径的柱子。1mg蛋白或多肽的纯化也可以采用10mm柱子，5mg纯化可采用22mm柱子。大批量蛋白或多肽的纯化采用50mm、100mm或内径更大的大内径柱子。

2、柱长

与分析柱比起来，制备柱通常较为短。因为在制备色谱法中，柱的总体积比柱长更为重要，尤其是蛋白的分离。

内径60cm、柱长12-15cm（“圆饼状”柱）的色谱柱已运用在蛋白的大规模纯化中。因为在制备色谱法中，柱通常过载，且收益的重要程度比不上总产量、纯度及通量重要，所以按照其实用价值而不是经济效益改进柱尺寸。

3、流动相组成

与分析色谱法相同，使用10~22mm内径柱的较小规模纯化较常用乙腈-TFA体系。大规模的纯化一般使用乙醇等溶液取代乙腈，选用乙酸代替TFA。虽然选用这种溶剂作流动相会降低分辨率，但是它们更加适合大规模的应用，且分辨率的下降与柱过载既有的分辨率损害一致

4、蛋白变性

普遍认为反相色谱可以让蛋白变性，所以洗脱得出来的蛋白并非天然蛋白，且很有可能没有生物活性。即使反相HPLC的操作要求会让蛋白变性，但洗脱后依然可以获得天然、具备生物活性的蛋白。

基于二硫键的作用，蛋白维持球形构造，且只出现局部去折叠，所以从反相柱洗脱出来的蛋白往往可通过在恰当的重折叠缓冲液中处理，进而复原其天然结构而恢复至tian然状态。

很多案例显示采用反相HPLC纯化之后的蛋白仍保持天然三级结构和生物活性。胰蛋白酶的反相纯化，当中活性得到了保留，且紧接着用来蛋白的胰蛋白酶酶切。

写到最后:

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