人巨细胞病毒抗原分支肽人工合成方法

1.线性肽的合成将PACPEGPS树脂0.5g（替代度0.2mmol/g）用N，N-二甲基甲酰胺（DMF）浸泡30min进行活化.。采用对称酸酐法将已经活化的树脂进行第一个氨基酸的连接.称取待连接的氨基酸195mg，加入1.5mL二氯甲烷（DCM）和3滴DMF使之溶解，加入1mol/L二环己基碳化二亚胺（DCC）/N甲基吡咯烷酮（NMP）275mL，磁力搅拌，室温下反应15min，反应完毕，过滤除去沉淀，蒸发掉过滤液中的溶剂，得到对称酐.将得到的对称酐溶于最少量的DMF中（保证最大浓度），加入到活化的树脂中，摇动1min，然后加入0.1mol/L，4二甲氨基吡啶（DMAP）/DMF460μL，摇动反应90min，吹去反应液，用10mLDMF洗涤3次，吹干。

其余7个氨基酸的连接采用原位活化法，将连接有第一个氨基酸的树脂放入反应瓶中，加入300mL/L哌啶/DMF溶液50mL反应15min，以脱去FMOC保护基团。取2.0mmol保护氨基酸，用1mol/LDIEA/DMF5mL溶解，加入4.0mmolTBTU和4.0mmolHOBT（DMF为溶剂），预反应15～20min，然后和氨基酸树脂一起反应2h，吹去反应液，50mLDMF冲洗3次，吹干。

将已合成好连接有全部氨基酸序列的树脂放入裂解容器中。按照TFA∶水＝95∶5(V/V)切割试剂，使用时按25mL切割试剂与1g树脂反应的比例进行切割，反应时间为2h.。将反应液快速倒入150mL乙醚中，收集沉淀，所用乙醚需预先放在低温冰箱中冷却。将沉淀重新加蒸馏水溶解，再转移到冻干机中冻干。

2.线性肽的脱盐用5mL固相萃取小柱，先用蒸馏水、500mL/L甲醇、蒸馏水各15mL进行平衡，每次上样0.5mL（1～2g/L），用蒸馏水15mL进行脱盐，按甲醇∶水＝85∶15(V/V)的比例配置洗脱液，15mL洗脱液进行样品的洗脱，洗脱液冻干后得样品。

3.在分支状多聚赖氨酸支架上用顺序法合成八分支肽将赖氨酸作为第一个氨基酸按1.2.1的方法进行连接.。每次均脱保护15min以上，偶联60min连接3次，得到八分支多聚赖氨酸骨架，将此支架上的赖氨酸作为合成肽的C端第一个氨基酸，依次进行八肽的连接。

4.在分支状多聚赖氨酸支架上用片段合成法制备八分支肽将分支状多聚赖氨酸做为第一个氨基酸，把已合成并纯化好的线性肽作为待连接的氨基酸按照片断合成法连接到该支架上.。将5.5mg（0.007mmol）线形肽和5mg（0.0007mmol）线形多聚赖氨酸按照10∶1的比例混合，加PBS缓冲液（pH7.4）5～10mL溶解；加少量20g/L戊二醛进行连接，每10min加入2mL,加3～4次，中间要摇晃或者采用磁力搅拌，反应完毕将溶液过G25凝胶柱子，收集，冻干，得到3mg左右连接好的复合物。

5.八分支肽的脱盐用G25凝胶15g，溶胀后装柱，装好后的柱子先用蒸馏水50mL进行平衡，每次上样3～5mL，蒸馏水进行洗脱，用核酸蛋白检测仪检测220nm处紫外吸收，按峰收集组分，将第一个峰的组分收集，冻干，成为脱盐的样品，冻干后备用。

6.HPLC纯化多肽用半制备HPLC，洗脱系统为：①A液：50mL/L乙腈/H2O溶液；②B液：950mL/L乙腈/H2O溶液.。手动进样，每次1mL，流速4mL/min，线性梯度，45min内.B液从50mL/L升到500mL/L，然后5min内升到950mL/L，B液做最后洗脱.220nm处检测紫外吸收，按峰收集组分，用于质谱检测.。将分子质量检测正确的组分收集，冻干，成为需要的纯品，备用。

7.质谱检验多肽采用激光解析质谱鉴定多肽，数据分析软件为G2025ASoftwareA.02.01，方法严格按照操作手册进行，检测合成多肽的分子质量。

写到最后：

杭州固拓生物科技有限公司定制多肽合成业务:药物肽、临床肽、订书肽、淀粉肽、醛肽、环肽、二硫键搭桥多肽、穿膜肽、各种抗菌肽、美容肽、磷酸化肽、PEG肽、偶联BSA和KLH抗原肽、各类酸修饰多肽、各种胺类化合物修饰多肽(苯胺、异戊胺、二乙胺)、各类荣光标记(FITC、FAM系列、DOTA、TAMRA系列、Cy系列)同位素肽等。

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