简述蛋白质、多肽液相色谱纯化方法及准备工作

1、纯化的常见目标和办法

第一，自然来源亦或是重组表达的蛋白质历经部分粗提的流程变成相对稳定的可用作色谱分离的样本。然后通过捕捉色谱，总体目标是浓缩和除掉大批量的比较容易消除的杂质，此步最看重的是流动速度和载量，常使用高载量、快流速凝胶。完成浓缩的那部分纯化的样品做好中级色谱，作用是去掉比较难消除的杂质，此步最看重的是分辨率，常使用高分辨率的细颗粒凝胶。最终为了获得满足条件的最终产品，除去残余的杂质还有目标蛋白的多聚物或是降解片段，展开精制色谱，常选用拥有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。

2、纯化的前期准备工作

（1）样本稳定性测试

a、检测试样在pH2-9系统的稳定性；b、检测试样在0-4mol/LNaCl及0-2mol/L硫酸铵中系统稳定性；c、检测样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；d、检测样品在4-40℃的稳定性；e、常温下放置隔夜，测量对蛋白水解酶的稳定性。

（2）样品预处理

a、除去样品中颗粒物体b、去除样品中脂类c、去除样品中核酸d、遏制样品中蛋白水解酶。

（3）样品的存放环境：短时间存储

a、防止达到或超过样品的稳定限制避免蛋白质变性或积淀b、在密封容器中冰箱保鲜较长时间存放c、加进恰当的抑菌剂长时间储藏冷冻或是尽量冻干保存。

3、对每个纯化方法步骤的评价有关办法的建立

a、目标蛋白含量测量酶活性测定、生物活性检验、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。b、总蛋白含量测定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法等。c、样品复杂性检验HPLC、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳(CE)。

4、蛋白质来源

（1）纯天然蛋白：天然产物中的目标蛋白通常成分非常少并且成分比较复杂，在分离流程中须选用多步骤才可以除去各种各样杂质，并应在操作过程中减少蛋白水解酶的活力。

（2）重组蛋白：重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要由以下三种表达定位：

a、细胞质：一定要损坏细胞结构才能获得目的蛋白质，而且还伴有大量核酸以及其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量相对较高的环境下，通常生成包涵体，包涵体富含过表达目的蛋白，而且容易通过高速离心分离，可是包涵体的溶解与复性是较为繁琐的。

b、外周质：表达的蛋白质分布于细菌内膜与外膜中间，这种目的蛋白能够很少地遭受蛋白酶的作用并降低了宿主蛋白的污染。

c、分泌到培养基：这样的表达通常蛋白质浓度不高，主要是受到培养基当中的环境污染。

写到最后:

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