核酸的纯化 ，浓缩和定量分析

核酸的提纯

在分子克隆的全部操作中，最主要的操作是核酸的提纯 。 其重要环节是去蛋白质 ，通常只需用酚/氯仿 , 氯仿抽提核酸的溶液就可以 。每每必须把复制有某一些常用的酶消灭或除去以便开展下一步时，可开展这类抽提 。

然而 ，若想从细胞裂解液等繁杂的分子结构混合物中提纯核酸 ，则要首先用 一些蛋白水解酶消化吸收绝大多数蛋白质后，再用有机溶剂抽提 。

这种广泛的蛋白酶包含链霉蛋白酶及蛋白酶K等，他们对多种多样纯天然蛋白均有活力 ，用酚氯仿抽提 ：这二种有机溶剂共用 ，比独立用酚抽提的除蛋白实际效果更好。 

进而用氯仿抽提则可去除核酸产品中的痕量酚。

①核酸样品置有盖小离心管中，添加等容积的酚/氯仿 。

②旋涡混匀管內容物，使呈乳状 。

③12000 ×g室内温度离心15 秒。

④水相移进另一 离心管 ，弃去两相页面和有机相。

⑤反复流程 ①－④步操作 ，直到两相页面上见不上蛋白质才行

⑦按以下核酸浓缩法沉淀回收核酸 。

核酸 的浓缩

运用较广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法 。在适中浓度价格阳离子存有下，添加一定量的乙醇 后，所产生有核酸沉淀可经离心而回收 ，乃至对低至pg量的DNA或RNA ，也可定量回收 。  回收的核酸可按所需浓度 ，再溶解适度的缓冲液中。具体步骤时，可以向含样品的小离心管中添加 V/10 价格 阳离子盐存储液2V无水乙醇 ，混匀 ，放冰水浴中15 －30 min ，取下目测平衡，0－4度，12000g，离心10min 。吸弃上清，再另70%乙醇0.5 －1ml ，12000 g，0－4度清洗 离心 2min 。吸弃上清，沉淀 用汽油泵排干或开启外盖晾晒后，溶解适度容积的缓冲液中。

价格阳离盐的挑选 ，关键根据以下考虑 ：用醋酸铵可降低dNTP的共沉淀 ，但在之后要作核酸的磷酸化时要防止用醋酸铵，因铵离子是T，多核苷酸激酶的明显抑制剂。 若用较高浓度的乙醇沉淀RNA 时，常见LiCl，因LiCl在乙醇中溶解性很高，不随核酸共沉淀 。 带有 SDS的核酸样品 ，应应用 NaCl ，这时该去垢剂要70%乙醇中仍保持可溶解 。DNA 和RNA沉淀 ，大多数应用醋酸钠（pH5.2）。

DNA ，RNA 的定量

精确的方式是紫外分光光度法 。 但此方法规定核酸样品是纯净的（即无明显的蛋白质，酚，琼脂糖或其他核酸 ，多肽链等污染物的产品 ）。 

用紫外光度计测量260 nm 和280nm 2个光波长处的吸光 ，随后 ，按IA260等同于50 μg/ml 双链DNA。 40 μg/ml单链DNA或RNA及20 μg/ml 多肽链寡核苷酸 。

测算 样品 成分 。 

260nm 和280 nm两个读数的参考值 （A260 /A280），可体现核酸的纯净度 。 

DNA和RNA 纯品 的A260 /A280的值各自为1.8 和2.0 假如样品中有蛋白质或酚的环境污染 ，则A260 /A280将明显小于此值，这时就没法对样品中的核酸开展精准定量。 

可将样品裂解后再作定量测量 。有充足实验室工作经验的人，光凭样品电泳后溴化乙锭上色萤光带的强度 ，就可以大概判断出样品中的核酸成分 ，故她们常未作核酸的紫外分光光度法定量 。

写到最后：

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